线粒体基因体外沉默系统(2)

线粒体通过运输一些核编码的蛋白以及表达线粒体基因组对其蛋白质组进行塑造。线粒体基因组表达需要通过线粒体RNA聚合酶POLRMT对线粒体基因组进行转录【1】。线粒体中的转录本逐渐成熟，这些成熟步骤会发生在线粒体RNA颗粒（Mitochondrial RNA granules）【2】中，这些颗粒中也会进行核糖体成熟以及RNA周转等步骤。因为OXPHOS对细胞功能至关重要，因此线粒体基因表达的每一步的缺陷都与人类疾病息息相关【3】。虽然已经对线粒体基因表达的一些关键因素比如POLRMT聚合酶有一定了解，但是我们对于基因表达如何整合到细胞和线粒体环境的仍然缺乏认知。因为目前还缺乏针对线粒体基因的操作技术，这是目前该领域发展的一个主要障碍。如何靶向线粒体RNA从而干扰基因表达过程是一个可供参考的新策略。
为此，作者们构建了一个体外系统可以靶向线粒体mRNA翻译的系统。该系统利用化学合成的蛋白质-吗啉嵌合体（Protein-morpholino chimera）导入到体外纯化出的线粒体中，从而能够特异地阻止mRNA的翻译。为此作者们表达并纯化的线粒体蛋白Jac1，之所以选择Jac1是因为体积小、折叠简单、可溶性好，并且其中只包含一个半胱氨酸。作者们发现荧光标记的Jac1能够有效地运输进入体外纯化的线粒体之中，并且在膜电位存在的情况下表现出对蛋白酶K的抵抗性。但是Jac1本身会在进入线粒体后进行加工，这一加工过程并没有有效地进行，所以作者们增加了一个DBCO（Dibenzocyclooctyne group）的修饰，进一步地作者们再将单链DNA、RNA寡核苷酸以及MO（Morpholino phosphorodiamidate oligonucleotides）共价连接上去。
作者们设计的MO是针对的COX1 mRNA的5’末端。COX1是线粒体编码细胞色素c氧化酶I。随后作者们检测的Jac1-COX1运输进入线粒体对COX1的翻译的影响，作者们发现在加入MO嵌合体后，COX1的翻译被显著降低。
进一步地，作者们对该系统的使用参数进行检测，从而使该系统能够在应用方面更加成熟。作者们发现在2μM的使用浓度下，Jac1-COX1-MO系统能够达到最显著地对于COX1的翻译的抑制，但是在较低的浓度0.5-1μM仍然能够有效地进行COX1的翻译抑制。另外，作者们发现该嵌合体系是通过TIM23信号通路移动进入线粒体之中。因此，Jac1-COX1-MO嵌合系统可以有效地靶向COX1 mRNA并且以很高的浓度选择性抑制COX1的翻译。通过该系统，作者们对COX1的生物合成步骤进行了解析。因此该结果证明体外嵌合体系将是很好的探究线粒体基因表达的工具。