解析表观遗传学的工具——ATAC-seq（一）(4)

图3 ATAC-seq的主要步骤(Sun et al., 2019)。（A）细胞核制备：在裂解缓冲液中裂解靶细胞收集细胞核。（B）转座酶反应：加入Tn5转座酶标记基因组DNA。绿色符号表示Tn5转座酶的“测序接头1”，红色符号表示Tn5转座酶的“测序接头2”。（C）PCR扩增：用PCR引物1和引物2生成测序文库。引物1和引物2是两个通用PCR引物，它们可以捕获特定长度的片段，并添加适合下一代测序的条形码。
注：这里的实验过程虽然是以动物实验为例进行说明的，但是同样适用于植物。
在测序前需要对ATAC-seq文库进行质量控制，从而保证文库浓度达到测序标准。对符合条件的文库进行测序，收集原始reads。通过对测序数据进行质量评估，以及对数据进行过滤后，进一步获得干净的reads(Davie et al., 2015；Bell et al., 2011；Mardis E R, 2008)。去除标签引物序列和低质量reads后，处理长度约150个核苷酸（nts）的高质量reads，进行进一步分析(Miskimen et al., 2017)。Peak calling reads被映射到参考基因组和可及性的染色质区域，如启动子、增强子和绝缘子(Kumasaka et al., 2016；Ackermann et al., 2016；Quillien et al., 2017)。
可以进一步进行一系列详细地分析，如确定全基因组reads的分布，确定峰长的分布，对具有识别峰的基因进行功能分析，基因功能元件上的峰的分布，以及样本间差异峰的分析等(Pranzatelli et al., 2018；Mu et al., 2012)。
4、
ATAC-seq技术的优缺点
4.1 ATAC-seq与其它技术的比较
ATAC-seq方法最初是作为微球菌核酸酶测序（MNase-seq）、甲醛辅助的调控元件分离（FAIRE-seq）和脱氧核糖核酸酶I测序（DNase-seq）的替代方法或补充开发出来的（表1）。对于MNase-seq和DNase-seq，当DNA和组蛋白的聚集减少时，未被保护的DNA暴露出来，这样就可以被DNA酶如MNase和DNase酶切割。通过对切割的DNA片段进行测序并与参考基因组进行比较，就可以识别可及性的染色质区域。这两种方法的缺点是耗时且重复性差。FAIRE-seq通过甲醛固定，苯酚氯仿萃取和分离来获得暴露的DNA，但其背景高，序列信噪比低，且甲醛交联时间不好把握。