「罗工流式宝典第1式」小鼠Treg细胞的鉴定、分离及体外抑制实验(2)

c) 补充适量2% RPMI培养基，4°C，300g离心5min，丢弃上清，用1ml 红细胞裂解缓冲液重悬细胞，室温孵育5min。
d) 加适量2%RPMI培养基中止裂解，4°C，300g离心10min，丢弃上清，在RPMI完全培养基（10ûS 1%双抗 1%L-谷氨酰胺 50μM 2-巯基乙醇）中以1×107 cells/ml的密度重悬细胞，等待后续实验。
2） Treg细胞的表型分析鉴定
a) 转移50μl淋巴细胞（5×105 cells）到96孔板中，再加入150μl FACS缓冲液，4°C，300g离心2min。
b) 丢弃上清，再使用200μl FACS缓冲液洗2遍，4°C，300g离心2min。
c) 准备含抗体的染色缓冲液（50μl/孔，抗体用量参考说明书）：anti-CD4，anti-CD25，anti-PD-1，死活染料。
注意：为了进一步分析活化Treg细胞的表型，可添加anti-CD103进行细胞表面标记物染色。
d) 每孔用50μl抗体缓冲液重悬细胞，4°C避光孵育20min，用FACS缓冲液洗涤细胞2次，4°C，300g离心2min。
e) 按厂家说明书制备固定缓冲液100μl，在4℃黑暗中固定细胞20min。用渗透性洗涤缓冲液(根据制造商的说明书准备)洗涤细胞2次，4°C，300g离心2min。
f) 制备细胞内Foxp3染色的抗体溶液（抗体用量参考说明书），用50μl 含anti-Foxp3抗体溶液重悬细胞。
g) 4°C避光孵育20min，用FACS缓冲液洗涤细胞2次，4°C，300g离心2min。用200μl FACS缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪检测细胞表型。

图2 小鼠脾脏Treg细胞表型分析
2. CD4 CD25 Treg细胞的分离纯化（磁珠分选）（Miltenyibiotec Cat: 130-091-041）