「罗工流式宝典第1式」小鼠Treg细胞的鉴定、分离及体外抑制实验(3)

a) 按步骤1）获得1×107 cells/ml细胞悬液。加入10ml T细胞分离缓冲液清洗细胞。4°C，300g离心10min。弃去上清，用40μl缓冲液重悬细胞。
b) CD4 T细胞磁性标记：加入10μl生物素-抗体混合物搅拌均匀，4°C孵育10min。
c) 加入30μl缓冲液，20μl抗生物素微珠标记non-CD4 T细胞，10μl CD25-PE抗体。搅拌均匀，避光孵育15min。
d) 加入2ml缓冲液，将细胞通过一个40μm的细胞过滤器，到新的50ml的管中，清除细胞碎片。4°C，300g离心10min，丢弃上清，用500μl缓冲液重悬细胞，浓度最高可达1.25×108个细胞。
e) 收集通过分选柱的未标记细胞。加入2ml缓冲液清洗分选柱，4°C，300g离心10min。将分离的CD4 T细胞完全弃去上清，用90μl缓冲液重悬。
f) CD25 细胞磁性标记：加入抗PE磁珠10μl，混合均匀，4℃避光孵育15min。
g) 加入2ml缓冲液，4°C，300g离心10min，丢弃上清，用500μl缓冲液重悬细胞，浓度最高可达1×108 cells。
h) 富集CD4 CD25 Treg细胞：将细胞涂于柱上进行阳性选择，并加入2ml缓冲液冲洗柱。重复3次。
i) 当最后洗涤后柱为空时，在柱上加1ml缓冲液，用柱塞冲洗磁性标记的CD4 CD25 细胞。
j) 重复h-i步骤，提高分离的CD4 CD25 Treg细胞的纯度。用FACS缓冲液洗涤细胞，4°C, 300g离心10min。丢弃上清，将分离的CD4 CD25 Treg细胞重悬于RPMI完全培养基中，浓度为2×106 cells/ml。
k) 为了检测分离的CD4 CD25 Treg细胞的纯度，从总分离的CD4 CD25 Treg细胞中提取的2×105个细胞。用50μl含anti-CD4和细胞活力检测试剂的FACS缓冲液。
l) 4°C避光孵育20min。用FACS缓冲液洗涤细胞， 4°C，300g离心2min。洗涤后用100μl FACS缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪检测纯度。
m) 从活细胞中分析Treg细胞纯度，确认CD4 CD25 细胞纯度。