「罗工流式宝典第1式」小鼠Treg细胞的鉴定、分离及体外抑制实验(4)

图3 Treg细胞分离后纯度分析
3. CD4 CD25 Treg和CD8 T体外抑制实验
a) 为了制备anti-CD3/CD28包被的磁珠：将适当体积的磁珠转移到15ml管中（2.5μl/1x105 cells）。 加入等体积的PBS并混合。4°C，300g离心2min，丢弃上清液。在完全培养基中稀释磁珠（50μl/孔）。
b) 取50μl CD4 CD25 Treg细胞（1×105 cells/孔）。每孔加50μl CD8 T细胞作为应答T (Tresp)细胞（1×105 cells/孔）。每孔加入50μl稀释后的anti-CD3/CD28。
注意：在此步骤中，标记和建立对照孔如下:未刺激CD8 T（不含anti-CD3/CD28）；刺激的CD8 T细胞（含anti-CD3/CD28）；刺激的Treg细胞（含anti-CD3/CD28）。Treg细胞可以用完全培养基稀释，以不同比例的Tresp细胞与Treg细胞（1:0.25-1:1）共培养。
c) 各孔加50μl或适当体积的培养基，总体积为200μl。用铝箔盖住板子，放入二氧化碳培养箱中37°C培养 72h。
d) 培养72h后进行细胞因子产生分析，将每孔上清液分离到另一个板上，进行酶联免疫吸附试验（ELISA），检测IFN-γ水平。
e) 将每孔上清液分离后，用FACS缓冲液清洗含有细胞的培养皿，4°C，300g离心2min，洗3次。
f) 洗涤后，弃去上清。用50 μl的抗体缓冲液（anti-CD4、anti-CD8和细胞活力检测试剂）重悬细胞，对增殖的CD8 T细胞进行染色（在获得CD8 T细胞时，可使用追踪细胞增殖的染料进行标记）。4°C避光孵育20min。
g) 4°C，300g离心2min，洗两次。洗涤后，弃上清，用100μl固定缓冲液4℃避光固定20 min。
h) 4°C，300g离心2min，洗两次。200μl FACS缓冲液重悬细胞，流式细胞术检测标记CD8 T细胞增殖情况。