同类种子中蛋白质的测定

一、染料结合-DBC法
方法原理
蛋白质中的碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸和组氨酸）的-NH、咪唑基和胍基以及蛋白质末端自由氨基在pH=2～3的酸性缓冲液体系中呈阳离子状态存在，可以和偶氮磺酸染料类物质如橘黄G、酸性橙12#等的阴离子结合，形成不溶于水的蛋白质一染料络合物而沉淀下来，通过测定一定量样品与一定量体积的已知浓度染料溶液反应前后溶液中染料浓度的变化，可计算出样品的染料结合量，即每克样品所结合的染料的毫克数。染料结合量的大小反映出样品中碱性氨基酸的多少。在小麦、大麦、水稻、大豆、花生等种子中蛋白质的含量与碱性氨基酸的含量之间有很好的相关性。因此，可以用染料结合量来评比同种作物种子大量原始材料之间蛋白质含量的高低。

如果要从柴料结合量来计算样品的粗蛋白质的含量，则需用开氏法测定同类种子的一批样品的粗蛋白质的质量分数，同时也用染料结合法测定其染料结合量，然后求出粗蛋白质含量（%）对染料结合量的回归方程或绘出回归曲线。这样，测定未知样品的染料结合量，就可以从回归方程计算或查回归线得到粗蛋白质（%）含量。若只需比较蛋白质含量的高低，如在筛选同种作物种子的大批样品时，不必知道蛋白质的绝对含量，只要测定样品的染料结合量即可进行比较。
该法是间接测定种子中蛋白质的方法。方法简单、快速，与开氏法的相关性较好，但准确性较差，适用于大批样品的筛选工作。美国谷物化学协会将该法列为分析小麦蛋白质含量的正式方法（AACC11-2-72）。现已有据此方法原理而设计的蛋白质分析仪。这里必须指出该法对随意混合物的样品不适用。
主要仪器： 万分之一天平、水平振荡器、离心机、GXD-201型蛋白质分析仪或721型分光光度计。
试剂
染料溶液（ED）。称取柠檬酸（C6H8O7·H2O，分析纯）20.70g和Na2HPO4 12H2O（分析纯）1.44g溶于300~400mL水，全部转入1000mL容量瓶中。另外准确称取橘黄G（C16H10O7N2S2Na2，分子量452.38）1.000g，加少量水在80℃水浴上溶解，无损地转入上述容量瓶中，再加入100g·L-1百里酚酒精溶液3~5滴以防腐，定容。此溶液为1.000g·L~l染料溶液。