同类种子中蛋白质的测定(3)

注2.样品称样量按蛋白质含量的高低而定。水稻、小麦、大麦等可称取500mg，玉米称取700mg，大豆称取200mg，花生及鱼粉等可少一些。
注3.染料结合反应的条件，如染料的pH、样品的粒度、振荡反应的时间和温度等影响到测定的结果，故应力求每次测定的反应条件一致，特别是测定样品与测定回归方程的样品时的反应条件一致。
二、双缩脲法
方法原理
蛋白质的肽键（

）结构，具有类似于双缩脲的反应基团。在碱性条件下能与Cu2 生成紫红色可溶性络合物，蛋白质含肽键多时反应呈紫色，反之肽键少时，反应呈红色。这种颜色反应称为双缩脲反应（或称缩二脲反应）。实验证明，蛋白质溶液浓度在1～15mg之间，其呈色溶液的吸收值与蛋白质含量成正比关系。故可用此反应进行蛋白质的测定。
本法须用开氏法作标准回归方程。经试验其与开氏法的相关性较好，适用样品广泛，如小麦、大麦、水稻、玉米和高粱等蛋白质的测定，皆能获得良好的效果，且方法快速，使用仪器设备简单，尤适用于大批品种选择用（注D。
主要仪器 ：恒温水浴锅、离心机、721型分光光度计。
试剂
双缩脲试剂。在500mL容量瓶中依次加入下列溶液，40g·L "CuSO4 30mL，25g·L-"酒石酸钾钠100mL，再缓慢加入5mol·L=1KOH30mL，用去离子水定容。使用时将此溶液与等体积透明的异丙醇混合。若溶液中出现浑浊或沉淀，则不宜使用（生2）。
操作步骤
（1）样品的测定。准确称取过60目筛的样品0.050～0.100g（含蛋白质在1～15g·L-2范围内），放入干燥试管中，再用移液管加入10mL双缩脲试剂，充分搅拌，于40℃水浴放置15min/*3），并经常搅拌。然后过滤或用4000r*min二离心10min（* ），取清液用550mm波长比色，从标准回归方程查得蛋白质含量。
（2）标准回归方程的测定。分别称取0.0500~0.120 0g待测定谷物样品20～30个（也可用蛋白质含量差异大的样品30个左右），先用开氏法测出其蛋白质的含量，然后按上法显色并测定吸收值A，作出标准回归方程。