同类种子中蛋白质的测定(2)

操作步骤
（1）标准曲线制作。与样品测定的同时，取1.000g·L-|的染料溶液10、30、50、60、70、80mL放入100mL容量瓶中，用水定容，即得浓度系列为0.1、0.3、0.5、0.6、0.7、0.8g·L 的染料标准溶液，用GXD-201型蛋白质分析仪测透光率（T），并用半对数坐标纸上绘制浓度——透光率（T）值的标准曲线。如无该型号的蛋白质分析仪，也可以把残余的染料溶液用水稀释50倍后，用0.5cm比色杯和482mm的波长，在721分光光度上测定吸收值（A）绘制标准曲线。
（2）样品的测定。称取通过0.25mm筛子的谷物样品（*2）200～700mg，放人30mL试管中，加入1mgmL-2染料溶液20mL，盖紧试管口，在水平振荡器上振荡60min，使样品和染料溶液充分反应（*），取反应后的浑浊液（8～10mL）注入离心管中，以3000r/min的速度离心8~12min，至上部溶液澄清为止，以下操作步骤同标准曲线。
（3）回归方程。选取粗蛋白质含量从低到高（如小麦种子粗蛋白质含量可以从7.0%～17.0%）的同一类谷物样品35个左右，用开氏法测其粗蛋白质含量（%），并用上述方法测定各样品的染料结合量。根据所得的结果，计算出染料结合量（mg·g l）与蛋白质含量（%）之间的回归方程。
结果计算 样品的染料结合量计算公式如下∶

样品的蛋白质含量（%）。将样品的DBC值（即“B”值）代人回归方程，计算样品蛋白质的含量。
注释
注1.在偶氮磺酸染料中，除橘黄G外，也可以使用酸性12*（Acid Orange12"，缩写AO12，C16H11O4N2SNa，分子量305.37），它的分子结构与橘黄G基本相同，也含有一个偶氮发色基团，但只有一个磺酸基，即一个结合碱基的位置（橘黄G二个），后者每个碱基结合点引起的颜色变化约是橘黄G的2倍。故其更适合于在染料结合法中应用，它们在482nm左右有一个较宽的吸收峰，便于比色测定。