蛋白质印迹法实验指南：第1部分，实验原理和样品准备(2)

由于免疫印迹的特异性，可以对用于蛋白质印迹的样品进粗略处，以提取蛋白质并将其转移到适合将样品引入分离凝胶进电泳的溶液中。由于存在诸如DNA之类的聚合生物分子，粗制样品尤其可能是粘性的，并且可能会影响凝胶加载。
例一：针对细菌培养样品的制备工艺1.取1ml大肠杆菌培养物样品并转移到冰上的微离心管中。2.在4°C下以13,000rpm转速旋转2分钟。3.弃去上清液。4.在50l上样缓冲液中重悬细胞，并在100°C下煮沸5分钟。5.3,000rpm离心5分钟。6.上样
例二：贴壁细胞例如哺乳动物(HEK293)的示例样品制备。 1.将组织培养板置于冰上，用冰冷的PBS清洗细胞。2.吸出PBS，然后加入适的裂解缓冲液（例如1mL/107个细胞/100mm培养皿150cm烧瓶；每5×106个细胞/60mm培养皿/75cm烧瓶0.5mL）。3.使用细胞刮刀从孔/烧瓶中分离细胞，然后用移液器吸头或通过胰蛋白酶化。4.将细胞悬液转移到预冷的微离心管中。5.然后在4°C下对样品进微离心。条件取决于细胞类型，应根据您的实验设置确定。例如，HEK293可以在1000rpm下耐受15分钟。6.从沉淀的细胞中吸出上清液并转移到冰上的新试管中。7.将负载染加入上清液并在100°C下煮沸5分钟。8.细胞沉淀也可与上清液一起上样染。
将样品以13,000 rpm的速度旋转5分钟，然后上样到凝胶中进电泳。
二、裂解和溶解为了使蛋白质能够进入分离凝胶，必须将样本进行裂解，因此样品制备的第一阶段是裂解。通过裂解提取细胞内表达的蛋白质，裂解会破坏细胞的质膜和/或细胞壁，以释放蛋白质。细胞外表达（分泌）的蛋白质需要裂解，尽管可以对细胞进处以观察由于合成当而捕获的蛋白质。
大规模蛋白质纯化——提取方法可以通过蛋白质印迹分析来自各种来源的蛋白质。样品可能来自蛋白表达系统，例如哺乳动物或细菌细胞培养物，或来自临床组织样品，每种都需要同的处来产生可用的印迹。