蛋白质印迹法实验指南：第1部分，实验原理和样品准备(3)

用于蛋白质提取的方法取决于样品的性质。蛋白质表达在哺乳动物、昆虫、细菌和酵母等同类型的细胞中进，一些样本可能来自组织；这些样本具有结构特异性因此需要实施同的处方式。
分泌蛋白哺乳动物或昆虫细胞系统中的一些蛋白质可能在上清液中表达，因此需要从细胞中提取。 tip：保留上清液样本，并在筛选表达时将其上样至细胞裂解液旁边的凝胶上。
筛选和处理蛋白质表达通常通过western blotting进行筛选。例如，几个克隆的表达可以进行相互比较，或者它们在同表达系统中具有不同的表达。在这些筛选试验中，从蛋白质样本中取出样品并上样用于分析。通常会将上清液与细胞沉淀进比较，以定位表达发生的位置。 Coomassie染色所观察到的总蛋白可以与在western blot中特异性检测到的靶点蛋白的表达进行比较。筛选试验中进的基本处可能能代表最终表达是如何处以供最终使用的，例如晶体学试验需要更精细的纯化步骤。

图 1：在一系列细胞裂解物中检测 His 标签蛋白。以100 ng的浓度将C末端His-Tagged蛋白添加到细胞裂解物中。将HEK 293、CHO、BL21 E.Coli和Sf9昆虫细胞的细胞裂解物还原并在100°C下煮沸5分钟，然后以9μg/孔的速度加载到联SDS凝胶中。A.蛋白质印迹。将凝胶电印迹到硝酸纤维素膜上，用PBS/0.2% Tween 20中的5% BSA封闭，并用Jackson ImmunoResearch的HRP Rabbit Anti-His Tag (300-035-240)探测以1:20K稀释并使用数字成像仪进可视化。 B.凝胶用Coomassie染色。
三、裂解缓冲液裂解缓冲液的目的是破坏细胞膜以释放蛋白质。裂解缓冲液通常包括破坏细胞膜脂质双层并形成胶束的去污剂。有许多缓冲液配方已经过验证，可用于同的细胞类型或蛋白质表达位置，例如裂解液RIPA或NP-40。材的加工应在冰上进，以尽减少因细胞成分带来的对蛋白质降解和变性。