蛋白质印迹法实验指南：第1部分，实验原理和样品准备(5)

Tween试剂非离子洗涤剂可用于增加非极性、不溶性蛋白质的溶解度。例如TritonX-100和Tween(r) - 20。
渗透压稳定剂 当从特定的亚细胞结构中纯化蛋白质时，例如来自真核细胞的细胞器、脂质膜或来自细菌周质空间的蛋白质，在细胞裂解步骤中需要加入渗透稳定剂，例如高浓度的蔗糖。它们的加入有助于在裂解过程中稳定亚细胞结构，还可以防止细胞壁降解过程中的细胞裂解。
在分离出的亚细胞结构的特定重力下进行离心，并加入密度梯度(如蔗糖或甘油分馏)，通常在western blotting前进一步富集亚细胞结构中的蛋白质。
渗透稳定剂的存在可能会影响蛋白质在凝胶上的迁移方式，并且样品可能需要在上样前稀释到同渗透强度的缓冲液中。
盐类添加盐以改变缓冲溶液的离子强度。加盐可提高蛋白质溶解度；然而，过多的盐会降低溶解度并使蛋白质沉淀。
通过优化溶液的离子强度，可以励蛋白质保持其折叠构象，从而通过防止受攻击的内部残基来阻止蛋白水解造成的损害。表面电荷的稳定会阻止蛋白质聚集。
样品澄清使用离心来澄清样品。它可以在裂解后使用，从而将细胞裂解物以非常高的速度超速离心较长时间以沉淀细胞碎片和染色体DNA，然后将其丢弃并保留含有溶解蛋白质的溶液。
对于在细胞外表达到培养基中的蛋白质，例如在哺乳动物细胞中，必须调整离心的速度和持续时间，以提供破坏性较小的条件以防止细胞裂解。离心，通常通过密度梯度，也用于分离细胞部分。例如，微粒体（内质网、质膜）可以在初始澄清后通过低速离心以高速沉淀。
未正确澄清的裂解物和高NaCl浓度的细胞成分残留物可能导致SDS-PAGE期间样品中的蛋白质分离正确，从而导致条带模糊或蛋获得非目的分子量的蛋白。
核酸的存在也会堵塞孔并影响样品迁移，因此可以添加脱氧核糖核酸酶(DNase)以消除这种污染物。也可以进透析或凝胶过滤以降低NaCl浓度。这些净化技术能够在电泳过程中实现准确的分离
样品浓度想情况下，应在上样前使用Bradford、Lowry或二辛可宁酸(BCA)测定等方法来确定样品的总蛋白质浓度。预先确定的样品浓度使分离凝胶中的孔能够加载相同的体积和浓度，以优化整个凝胶的一致性。如果将过多的蛋白质装入孔中，则会影响相邻泳道中蛋白质的迁移，从而难以解释结果。
根据孔的大小，每条泳道10-50g的总蛋白量就足够了。但是，如果使用纯蛋白质，这个重量可能会过于浓缩。