蛋白质印迹法实验指南：第1部分，实验原理和样品准备(6)

低丰度蛋白可能需要浓缩，以便于western blot检测。纯化标记(如HIS6标记)允许使用亲和柱(如镍)浓缩蛋白质。确保洗脱缓冲液与加载缓冲液兼容是很重要的。另外，如果有针对特定蛋白质的抗体，可以使用免疫沉淀等方法有效地浓缩蛋白质。
蛋白质浓缩大型蛋白质制备通常需要在纯化步骤中进浓缩步骤，以将材体积减少到于管的尺寸。亲和、离子交换和金属色谱或切向流过滤可用于去除多余的液体体积并浓缩总蛋白或目标蛋白。 WB样品可能需要浓缩步骤，因为由于技术的敏感性，蛋白质的丰度太可能低于检测限。
最佳蛋白质浓度在孔中加载过多的蛋白质会导致蛋白质意外迁移，但设置当也会导致蛋白质迁移，例如当加载缓冲液中盐或变性剂（如盐酸胍）浓度过高时。此外，在凝胶或蛋白质印迹运期间过度升高温度的凝胶运条件（例如，运缓冲液中的电压或盐浓度过高）会对蛋白质分离产生负面影响。请参阅第4章，了解如何解决相关的技术问题。
下表列出了一些常见的样本准备问题

四、上样条件及缓冲液在上样之前，将样品与上样缓冲液混合，这有助于蛋白质变性和将样品上样到分离凝胶中。它通常是染、还原剂和变性剂以及甘油的组合。
然后将样品在100°C下煮沸5分钟，然后在上样前短暂离心。在某些情况下，对于高度疏水的整合膜蛋白，需要低于100°C的温度。
染色剂上样将加载染添加到样品中，以可视化电泳期间的加载和样品迁移。一种常用的上样缓冲液 Laemmli上样缓冲液是溴酚蓝、甘油、Tris、SDS和还原剂（如DTT或BME）的组合。由于体积小，溴酚蓝比样品中的蛋白质迁移速度快，并提供了一个迁移前沿来监测电泳过程并防止样品流失。如果遇到酸性条件，它也会变黄，表明缓冲系统足，或省略了处步骤。甘油使样品比运缓冲液稠密，使样品能够“下沉”到孔的底部。在加载缓冲液中煮沸样品后，将样品短暂离心。