蛋白质印迹法实验指南：第1部分，实验原理和样品准备(4)

蛋白酶及其抑制 溶解的方法，如涉及到对细胞的机械破坏过程，会导致细胞内蛋白酶的释放。这些蛋白酶可以消化和截断感兴趣的蛋白质，这可能会导致在膜上观察到多个条带。
蛋白质对蛋白酶的敏感性取决于它们的氨基酸组成，细胞内蛋白质比细胞表面或细胞外蛋白质的抵抗力低。膜蛋白被洗涤剂溶解时，特别容易被蛋白酶降解。生物信息学工具可以提前预测蛋白质对蛋白质水解的敏感性。蛋白酶抑制剂可用于防止蛋白质水解;它们可以是化学抑制剂和酶抑制剂的混合物，可以加入裂解缓冲液中，然后再加入细胞或储存蛋白质的缓冲液中。
有一系列的抑制剂可以对常见种类的丝氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸蛋白酶，以及米诺肽酶和金属蛋白酶起效。不同的表达系统或对蛋白质活性抑制的敏感性可能会阻止某些抑制剂的使用。通常可使用蛋白酶抑制剂的专有混合物，或单独的试剂也可以应用。
在缓冲液选择上，叠氮也可以是蛋白酶的来源以防止细菌生长。去磷酸化可能发生在细胞被裂解之后。如果磷酸化的蛋白是western blotting的目标蛋白，那么磷酸酶抑制剂，如钒酸钠（sodium vanadate），也应该添加到裂解缓冲液。样品应在整个样品制备过程中冷藏，以尽量减少降解和去磷酸化的可能性。
下表列出了一些抑制剂和添加剂的例子：

pH裂解缓冲液的pH值对于样品制备过程中的控制很重要，以确保稳定性和蛋白质的活性得以维持。通过使用正确pH值的缓冲液，可确保蛋白质稳定性和溶解度，防止聚集和沉淀。与稳定性相关的是蛋白质的活性。使用正确的pH值可确保留蛋白质以供下游使用。
缓冲液的pH值通常比蛋白质等电点高或低一个pH单位，通常在pH6和8之间的生范围内。使用含有弱酸与其共轭碱的组合，或弱碱与其共轭酸的组合。下表为大家列出了常见缓冲液及它们的pH范围。